بررسی تاثیر عصاره هیدرواکسی گزنه بر تغییرات هورمون تسترون و اسپرماتوژتر در موش صحرایی

Transcript

1 مجله تازه هاي بیوتکنولوژی سلولي- مولكولي دوره چهارم شماره چهاردهم بهار 1393 بررسی تاثیر عصاره هیدرواکسی گزنه بر تغییرات هورمون تسترون و اسپرماتوژتر در موش صحرایی 1 علی قربانی رنجبری 1* نازنين قرباني رنجبري,1 2 زهرا قرباني رنجبری 2 ستایش قربانی رنجبری 1 باشگاه پژوهشگران جوان واحد كازرون دانشگاه آزاد اسالمي کازرون ايران. 2 دانشکده شیالت و منابع طبیعی دانشگاه بین المللی خرمشهر مقدمه و هدف: افزایش بی رویه جمعیت در جهان امروز یک مساله پیچیده و بحرانی برای آینده است. هم چنین شواهد نشان از افزایش گیاهان قابل دسترس و سودمندی دارد که دارای پتانسیل ضد باروری و تنظیم کننده تولیدمثل در مردان هستند. باتوجه به ترکیبات موجود در گزنه و کاربرد گسترده آن اطالعات اندکی در مورد تاثیر عصاره گزنه بر بیضه وجود دارد. لذا در تحقیق حاضر تاثیر عصاره هیدروالکلی گیاه گزنه dioica( )Urtica بر محور هیپوفیز- گناد یعنی میزان هورمون هاي LH, FSH و تستوسترون و اسپرماتوژنز و بافت شناسی بیضه ها مورد بررسی قرار گرفت. روش کار: 40 سر موش صحرایی نر بالغ از نژاد ویستار با وزن تقریبی 195±5 گرم به 5 گروه تایی تقسیم شدند. حيوانات گروه های تجربی به ترتیب مقادیر میلی گرم بر کیلو گرم عصاره گزنه را به صورت داخل صفاقی به مدت 2 روز دریافت کردند. گروه شاهد فقط حالل دارو )آب مقطر( دریافت کرد و گروه کنترل بجز آب و غذا هیچ ماده ای دریافت نکرد. از تمام گروه ها در پایان روز 2 خونگيري به عمل آمد. از نمونه هاي خوني جمع آوري شده برای اندازه گیری غلظت سرمي هورمونهاي LH, FSH و تستوسترون استفاده شد. هم چنين از بيضه ها مقاطع بافتي تهيه گردید و تغییرات بافتی بین گروه های تجربی و کنترل نیز بررسی شد. نتایج به دست آمده با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه ANOVA و t-test ارزیابی شد. نتایج: نتایج به دست آمده نشان مي دهد میزان 75 میلی گرم بر کیلوگرم از عصاره هیدروالکلی گزنه سطح تستوسترون سرم خون را در مقایسه با گروه کنترل در سطح آماری p 0/05 بطور معنی داري كاهش می دهد. میزان هورمون های FSH وLH بین گروه های تجربی و کنترل اختالف معنی داری نشان نداد. بررسی مقاطع بافتی نشان مي دهد تراکم اسپرم تعداد سلولهای اسپرماتوگونی اسپرماتوسیت اولیه اسپرماتید و الیدیگ در گروه تجربی دریافت کننده 75 میلی گرم بر کیلوگرم کاهش معنی داری نسبت به گروه کنترل دارد. همچنين وزن بدن و وزن بيضه ها در گروه هاي دريافت كننده ميزان 75 و 50 ميلي گرم بر كيلوگرم از عصاره هیدروالکلی گياه گزنه در مقايسه با گروه كنترل نيز در سطح آماري p 0/05 داراي كاهش معني دار مي باشد. نتیجه گیری: با توجه به نتایج به دست آمده و بررسی دیگر محققین احتماال عصاره گزنه با دارا بودن تركيبات فیتواسترول و فيتواستروژني خاصیت ضد آندروژنی داشته و میزان تستوسترون را کاهش می د هد. در بررسی بافت شناسی تغییرات مورفولوژیکی در لوله های اسپرم ساز تخریب سلول های بینابینی و نیز تحلیل اپیتلیوم زاینده اسپرم ساز مشاهده شد. کلمات کلیدی: گزنه تستوسترون FSH LH, اسپرماتوژنز مقدمه: افزایش بی رویه جمعیت در جهان به خصوص در کشورهای آدرس نویسنده مسئول : باشگاه پژوهشگران جوان واحد كازرون دانشگاه آزاد اسالمي کازرون ايران. dr_alighorbani7@yahoo.com تاریخ دریافت مقاله: 91/6/26 تاریخ پذیرش: 92/3/12 در حال توسعه مساله پیچیده ای است که امروزه بشر با آن روبروست. این رشد بی رویه جمعیت عمدتا ناشی از باالبودن باروری و ناکارایی داروها وسایل جلوگیری ازحاملگی است. با توجه به عوارض جانبی داروهای شیمیایی توجه بسیاری از محققین به سمت استفاده از گیاهان دارویی معطوف گشته

2 تازه های بیو تکنولوژی سلولی - مولکولی دوره چهارم شماره چهاردهم بهار 1393 بررسی تاثیر... سولفور تیامین 0/-5/4 آب 2000 روی در طب سنتی از گیاه گزنه به عنوان تقویت کننده مو دستگاه هاضمه ادرارآور بند آوردن خونريزي و درمان بيماري قند نیز استفاده شده است. براي بر طرف كردن درد رماتيسم برگ هاي تازه گزنه را روي پوست مي مالند )26 ( عصاره گزنه دارای ترکیباتی مانند پالمتیک اسید لینولئیک اسید فرولیک اسید اسکوپلتین سروتونین سیتوسترول و... می باشد. كومارين نیز یکی از ترکیبات موجود می باشد که داروي كشنده جانوران جونده مثل موش محسوب مي شود كه به طور وسيعي به 3 و 4 كومارين اپوكسيد متابوليزه مي شود كه اين تركيب باعث خونريزي داخلی مي شود. كومارين ضد ميتوز مهار كننده آلدوز ردوكتاز مهار كننده سنتز پروستاگالندين ها مهار كننده ليپواكسيژناز و ضد باروري مي باشد )1(. با توجه به اینکه بررسی هایی در زمینه اثر عصاره گزنه بر فعالیت تولیدمثلی جنس نر و عملکرد بیضه صورت نگرفته است. در این تحقیق تاثیر عصاره هیدروالکلی گیاه گزنه dioica( )Urtica بر میزان هورمون های LH,FSH و تستوسترون و نیز تغییرات بافت بیضه در موش صحرایی نر بالغ مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش کار تهیه گیاه و عصاره گیری ابتدا قسمت هوايي گياه گزنه از اطراف شهرکازرون- فارس جمع آوری شد. پس از تميز كردن در سايه به مدت دو هفته خشك شد. سپس به كمك آسياب برقي پودر گرديد. 900 گرم پودر از اين گياه را در ظرف شيشه اي درب داري ريخته و به ميزان مساوي اتانول %96 و آب مقطر اضافه گرديد و به مدت چهار روز خيسانده شد. طي اين مدت بطور متناوب محتويات ظرف با استفاده از همزن مرتبا هم زده شد تا عصاره در الكل بطور كامل حل شود. سپس آن را صاف كرده عصاره هیدروالکلی توسط دستگاه سانتريفيوژ با دور 450 در دقيقه به مدت دقيقه سانتريفيوژ گرديد. مايع حاصل در ظروف در باز قرار داده شد تا الكل آن تبخير شد. سرانجام يك شيره سبز رنگ غليظ بدست آمد كه براي تغليظ بيشتر عصاره در درجه حرارت درجه سانتي گراد در اون قرار گرفت. در مرحله بعد مقادير مورد نظر در آب مقطر حل شد تا اينكه غلظت هاي مختلف به 32 است )9). گزنه گياهي است علفي چند ساله و داراي ساقه هاي راست به ارتفاع 5/. تا يك متر و حتي بيشتر كه غالبا در اماكن مخروبه باغها و نقاط مرطوب خارج شهر به حالت خودرو مي رويد و شامل واریته های U.urens Urtica dioica U. cannabinal U. membranacea Poire U.pilulifera U.kiovensis Rogoff L مي باشد. در بين اين واریته هاي مختلف Urtica dioica و U.urens L به عنوان گياهان داروئي از زمان هاي بسيار دور مورد توجه قرار داشته اند) 15 23(. گزنه اعضاي پوشيده از تارهاي مخروطي شكل و گزنده دارد كه در صورت لمس كردن محتويات سوز آور آن در پوست بدن وارد مي گردد كه توليد خارش و سوزش مي كند و شايد به همين دليل آن را گزنه ناميده اند. ترکیبات موجود دراندام های مختلف گیاه گزنه ) 4 و 14 ( در جدول شماره 1 آورده شده است. جدول 1- ترکیبات موجود در گیاه گزنه میزان بر حسب ppm /02-0/ /1-1 0/03-0/ /4-7/ /005-0/ ترکیبات موجود در گیاه گزنه آلفا- توکوفرول آلومینیوم ارسنیک اسکوربیک اسید بتا کاروتن بور برم کلسیم کربوهیدرات سلولز کلر کلروفیل کروم کبالت مس چربی فلوئور گلیسرول آهن سرب لینولئیک اسید لینولنیک اسید منیزیم منگنز جیوه نیتروژن اولئیک اسید پالمتیک اسید پنتوتنیک اسید فسفر پتاسیم پروتئین ریبوفالوین سروتونین سیلیسیوم سدیم

3 تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره چهارم شماره چهاردهم علی قربانی رجنبری و همکاران 33 دست آمد )1(. حیوانات موردآزمایش و تعیین گروه تجربی در این بررسی تجربی 40 سر موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار با وزن تقریبی 15±5 گرم از موسسه سرم سازی رازی شیراز تهیه گشت. به حیوانات پس از انتقال به خانه پرورش حیوانات دانشکده دامپزشکی کازرون یک هفته فرصت داده شد تا با محیط سازگاری پیدا کنند. این حیوانات در شرایط 12 ساعت روشنایی/ 12 ساعت تاریکی قرار گرفتند و پس از رسیدن به وزن تقریبی 195±5 گرم به 5 گروه تایی تقسیم شدند. حيوانات گروههای تجربی به ترتیب مقادیر میلی گرم بر کیلو گرم عصاره گزنه را به صورت داخل صفاقی به مدت 2 روز دریافت کردند. گروه شاهد فقط حالل دارو )آب مقطر( دریافت کرد و گروه کنترل بجز آب و غذا هیچ ماده ای دریافت نکرد. روش تجويز عصاره گزنه عصاره گزنه پس از حل كردن در آب مقطر استريل با غلظت هاي مناسب هر روز یک مرتبه به مدت 2 روز تزريق شد براي تجويز عصاره گزنه از سرنگ هاي انسوليني استفاده شد. تجويز دارو به صورت داخل صفاقي بود )5 (. گروه كنترل: شامل سر حيوان بود و به عنوان گروه كنترل گروه بندي شدند. در اين گروه كليه شرايط با ساير گروه ها يكسان بود با اين تفاوت كه حيوانات اين گروه به جز آب و غذا هيچ ماده يا دارويي را دريافت نكردند. گروه شاهد: شامل سر حيوان بود و به عنوان گروه شاهد گروه بندي شدند. حيوانات اين گروه روزانه مقدار 0/2 ميلي ليتر آب مقطر به عنوان حالل دارو به صورت تزريق داخل صفاقي دريافت كردند. گروه های تجربی که عصاره گیاه را در غلظت و 75 میلی گرم بر کیلوگرم دریافت کردند )=n( )5(. روش خون گيري از حیوانات و خارج کردن بیضه ها از تمام حيوانات در روز بيست و نهم ( يك روز بعد از مصرف آخرين وعده دارويي ) بوسيله بيهوشي خفيف با اتر خونگيري از ناحيه قلب انجام شد. سپس خون موجود در سرنگ بسرعت داخل لوله آزمايش كوچك كه فاقد هر گونه ماده ضد انعقاد بود منتقل شد. از كليه موشها به همين روش خونگيري شد حدود 15 دقيقه بعد لوله هاي جمع آوري شده را در دماي 37 درجه سانتيگراد قرار داده و پس از وقوع انعقاد لوله ها داخل سانتريفيوژ به مدت 15 دقيقه و با سرعت 5000 دور در دقيقه قرار داده شد سپس لوله ها از سانتريفيوژ خارج و سرم خون كه فاز جداگانه اي روي بخش لخته شده تشكيل داده با دقت فراوان به كمك پي پت پاستور جدا گرديد و داخل لوله آزمايش معمولي ريخته شد و تا زمان سنجش های هورمونی در دمای منفی 20 درجه سانتیگراد نگهداری شد. همچنین با ایجاد برش در ناحیه شکم با احتیاط و به آرامی بیضه ها و اپیدیدیم را به وسیله پنس و قیچی خارج کرده ودر محلول فیکساتور فرمالین با PH= 7 قرار گرفت. اندازه گیری هورمون ها به روش رادیوایمونواسی 1 و تهیه مقاطع بافتی براي سنجش هورمونها از روش RIA استفاده گرديد. RIA روشي است كه براي مقاصد تحقيقي روزمره كاربرد دارد. اين روش از لحاظ قدرت تكرارپذيري و سادگي در پيشرفت بوده است. براي اين كار سرم خون فاقد مواد نشاندار )آنتي ژن غير نشاندار( در ظرفي ريخته و سپس هورمون نشاندار شده با I 125 )آنتي ژن نشاندار( به آن اضافه گرديد. هر دوي اين آنتي ژنها براي اتصال به آنتي بادي نشاندار استاندارد كه به محلول اضافه شده است با يكديگر رقابت مي كنند. اما ابتدا آنتي بادي به آنتي ژن غير نشاندار متصل شده و اضافه آن به آنتي ژن نشاندار متصل مي شود. محلول بااليي موجود در ظرف را كه حاوي آنتي ژن نشاندار آزاد و آنتي ژن غير نشاندار متصل به آنتي بادي است را دور ريخته و رسوب كه حاوي آنتي ژن نشاندار متصل به آنتي بادي است در ته ظرف باقي مي ماند. رسوب در داخل دستگاه گاماكانتر قرار داده شده خوانده مي شود. حال عدد خوانده شده نشان دهنده ميزان آنتي ژن راديو اكتيو متصل شده مي باشد. يعني هر چه عدد بيشتري خوانده شود ميزان هورمون اصلي درون سرم كمتر است زيرا باعث شده مقدار بيشتري از آنتي ژنهاي نشاندار به آنتي بادي استاندارد و نشاندار متصل شود )16 (. 10 آماده سازی و تهیه مقاطع بافتی با استفاده از رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین انجام شد. مقاطع بافتی تهیه شده از بیضه های راست و چپ با استفاده از میکروسکوپ و فتومیکروگراف بررسی شد و شاخص های زیر مورد بررسی قرارگرفت. در هر اساليد كه برش عرضي 1 1-Radio Immuno assay (RIA)

4 تازه های بیو تکنولوژی سلولی - مولکولی دوره چهارم شماره چهاردهم بهار 1393 بررسی تاثیر بافت بيضه را نشان مي داد ابتدا كل بافت از نظر تراكم لوله هاي اسپرم ساز و همچنين مورفولوژي مورد بررسي قرار گرفت سپس از 5 قسمت مختلف بافت بطور تصادفي 5 لوله اسپرم ساز انتخاب گرديد و در هر كدام 1/4 لوله در نظر گرفته شد و تعداد سلولهاي اسپرماتوگوني اسپرماتوسيست I و اسپرماتيد شمارش شد و نتيجه حاصل در عدد 4 ضرب گرديد تا تعداد كل اين سلولها در يك لوله بدست آيد سپس ميانگين اعداد بدست آمده در 5 لوله براي هر رده سلولي حساب شد. همچنين تراكم اسپرمها در لوله هاي اسپرم ساز انتخاب شده مورد مطالعه قرار گرفت و نيز تعداد سلولهاي بينابيني بين اين لوله ها و لوله هاي مجاور شمارش شد و ميانگين آنها نيز بدست آمد. آنالیز آماری به منظور آناليز آماري نتايج و مقايسه اختالف ميانگين وزن حيوانات قبل و بعد از آزمايش در هر گروه و بين گروههاي مختلف و همچنين به منظور اختالف ميانگين وزن بيضه هاي چپ و راست در پايان دوره آزمايش در هر گروه و بين گروههاي مختلف از روشهاي T-Test و ANOVA استفاده شد. به منظور ارزيابي ميانگين غلظت هورمونهاي تستوسترون LH و FSH در پنج گروه از روش ANOVA استفاده شد و سپس گروهها به صورت جفت با كمك روشهاي Duncan و Tukey مقايسه گرديد. به منظور مقايسه ميانگين تعداد سلولهاي اسپرماتوگوني اسپرماتوسيست اوليه سرتولي و بينابيني از روشهاي T-Test Dunca Tukey ANOVA و Post Hoc Test استفاده شد. تمامي تجزيه و تحليل ها با استفاده از برنامه 17SPSS انجام گرفت. كليه نتايج بصورت SEM( ) X ± و سطح معني دار بودن نتايج حداقل با 0/05 p در نظر گرفته شد. نتایج: تاثير عصاره گزنه بر وزن بدن تغييرات وزن بدن بعد از انجام آزمايش در گروههاي مختلف در جدول 2 نشان داده شده است. ميانگين وزن بدن در گروه تجربي 2 با دوز 50 و mg/kg در گروه تجربي 3 با دوز mg/kg 75 نسبت به ميانگين وزن بدن در گروه كنترل و گروه شاهد كاهش معنی داری را در سطح 05 /0 p نشان می دهد. همچنین ميانگين وزن بيضه هاي راست و چپ در گروه تجربي 2 با دوز 50 mg/kg و در گروه تجربي 3 با دوز 75 mg/kg نسبت به ميانگين وزن بيضه هاي راست و چپ در گروه كنترل و گروه شاهد كاهش داشته كه در سطح 05/ 0p داراي اختالف معني داري مي باشد. جدول :2 مقایسه میانگین وزن بدن در گروههای تجربی دریافت کننده مقادیر مختلف عصاره گزنه در مقایسه با گروه کنترل گروههای مختلف مورد آزمایش کنترل شاهد تعداد حیوانات در هر گروه میانگین وزن بدن بر حسب گرم±خطای معیار )± SEM X ( 209/7±5/1 200/2±4/5 200/0±4/ 172/50±4/2 * 155/62±3/7 * دوزحداقل) 25 mg/ ) kg دوزمتوسط 50( mg/ ) kg دوزحداکثر) 75 mg/ )kg * (p 0/05( عالمت * نشان دهنده اختالف معنی دار بین گروههای تجربی با گروه کنترل است. نمودار شماره 1 تغييرات غلظت سرمي هورمون LH را در گروههاي مختلف نشان مي دهد ميانگين غلظت پالسمايي هورمون LH در گروه تجربي 2 با دوز 50 mg/kg و در گروه تجربي 3 با دوز 75 mg/kg نسبت به ميانگين غلظت پالسمايي در گروه كنترل و گروه شاهد افزايش داشته كه در سطح 0/05 p داراي اختالف معني دار نمي باشد. تغييرات غلظت سرمي هورمون FSH را در گروههاي مختلف نشان مي دهد ميانگين غلظت پالسمايي هورمون FSH در گروه تجربي 1 با دوز 25 mg/kg ودر گروه تجربي 2 با دوز 50 mg/kg و در گروه تجربي 3 با دوز 75 mg/kg نسبت به ميانگين غلظت پالسمايي هورمون FSH در گروه كنترل و گروه شاهد اختالف معني داري در سطح 0/05 p نشان نمي دهد. mg/kg) 25 )گروههاي مختلف نمودار 1 میانگین غلظت سرمی هورمون LH در گروههای تجربی دریافت کننده مقادیر مختلف عصاره گزنه در مقایسه با گروه کنترل میانگین غلظت سرمی هورمون ( IU/Lit ) LH تجربی 3 تجربی 2 تجربی 1 (m g/kg) 50 ( m g/kg) 75 شاهد کنترل

5 تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره چهارم شماره چهاردهم علی قربانی رجنبری و همکاران تاثير عصاره گزنه بر غلظت سرمي هورمون تستوسترون نمودار شماره 2 تغييرات غلظت سرمي هورمون تستوسترون را در گروههاي مختلف نشان مي دهد. ميانگين غلظت سرمي هورمون تستوسترون در گروه تجربي 3 با دوز 75 mg/kg نسبت به ميانگين غلظت سرمي هورمون تستوسترون در گروه كنترل و گروه شاهد كاهش داشته كه در سطح 0/05 p داراي اختالف معني داري مي باشد. میانگین غلظت سرمی هورمون تستوسترون (IU/Lit) نمودار 2 میانگین غلظت سرمی هورمون تستوسترون در گروههای تجربی دریافت کننده مقادیر مختلف عصاره گزنه در مقایسه با گروه کنترل تاثير عصاره گزنه بر تعداد سلولهاي بافت بيضه ميانگين تعداد سلولهاي اسپرماتوگوني اسپرماتوسيت اوليه سلولهاي اسپرماتيد و سلولهاي بينابيني در گروه تجربي 3 با دوز 75 mg/kg نسبت به ميانگين تعداد سلولهاي اسپرماتوگوني در گروه كنترل و گروه شاهد كاهش داشته كه در سطح 0/05 p داراي اختالف معني داري مي باشد. اما ميانگين تعداد سلولهاي سرتولي در گروه تجربي 1 با دوز 25 mg/kg ودر گروه تجربي 2 با دوز 50 mg/kg و در گروه تجربي 3 با دوز 75 mg/kg نسبت به ميانگين تعداد سلولهاي سرتولي در گروه كنترل و گروه شاهد اختالف معني داري در سطح 0/05 p اسپرم ساز در گروه شاهد نسبت به گروه كنترل از نظر تعداد اندازه فضاي بينابيني ساختار لوله هاي اسپرم ساز و تراكم سلولهاي درون لوله انجام نگرفته است )تصاویر شماره 2 3 و 4 (. اما بررسی فتومیکروگرافی تهیه شده از لوله های اسپرم در گروه تجربی 3 و مقایسه آن با شکل 1 در گروه کنترل نشان دهنده تغییرات بافتی در این لوله ها است از جمله اینکه لوله های اسپرم ساز در گروه تجربی 3 کمی مورفولوژی طبیعی خود را از دست داده اند و ظاهر آنها کمی از حالت مدور خارج شده است همچنین تعداد لوله های اسپرم ساز کاهش پیدا کرده و مقدار فضای بینابینی افزایش یافته و سلولهای درون لوله ها نسبت به گروه کنترل )اصطالحا از نظر آماری کاهش معنی دار داشته( است )تصویر شماره 5 (. تصویر شماره 1 - فتومیکروگراف لوله های اسپرم ساز در گروه کنترل بزرگنمایی 100 )لوله های اسپرم ساز با تراکم زیاد فاصله کم وبسیار مرتب در بافت بیضه مشاهده می شود.( تصویر شماره 2 فتومیکروگراف لوله های اسپرم ساز در گروه شاهد بزرگنمایی * کنترل شاهد تجربی 1 تجربی 2 تجربی 3 (m g/kg) 25 (m g/kg) 50 ( mg/kg) 75 گروههاي مختلف 35 نشان نمي دهد. نتايج حاصل از مطالعات ميكروسكوپي بافت بيضه در گروه كنترل لوله هاي اسپرم ساز با تراكم زياد فاصله كم و بسيار مرتب در بافت بيضه ديده شد. كليه لوله هاي اسپرم ساز داراي شكلي گرد و با تراكم سلولي زياد و آرايش مرتب بودند. درون لوله هاي اسپرم ساز تمايز سلولي از اسپرماتوگوني تا اسپرم بالغ با نظم و آرايش مرتب وجود داشت )تصویرشماره (. 1 بررسي فتوميكروگراف تهيه شده از لوله هاي اسپرم ساز گروه شاهد تجربی 1 و تجربی 2 و مقايسه آن با تصویرشماره 1 در گروه كنترل نشان مي دهد كه تغييرات بافتي در لوله هاي 100 )تغییرات بافتی از نظر تعداد ساختار و شکل لوله های اسپرم ساز نسبت به گروه کنترل صورت نگرفته است.(

6 تازه های بیو تکنولوژی سلولی - مولکولی دوره چهارم شماره چهاردهم بهار 1393 بررسی تاثیر تصویر شماره 3 فتومیکروگراف لوله های اسپرم ساز در گروه تجربی 1 بزرگنمایی 100 )تغییرات بافتی از نظر تعداد ساختار و شکل در لوله های اسپرم ساز نسبت به گروه کنترل صورت نگرفته است.( تصویر شماره 4 فتومیکروگراف لوله های اسپرم ساز در گروه تجربی 2 بزرگنمایی 100 ) تغییرات بافتی از نظر تعداد ساختار و شکل لوله های اسپرم ساز نسبت به گروه کنترل صورت نگرفته است.( تصویر شماره 5 فتومیکروگراف لوله های اسپرم ساز در گروه تجربی 3 بزرگنمایی 100 )لوله های اسپرم ساز مورفولوژی طبیعی خود را از دست داده اند همچنین تعداد لوله های اسپرم ساز کاهش یافته است.( بحث: با توجه به نتايج به دست آمده مي توان نتيجه گيري كرد كه ميانگين غلظت پالسمايي هورمون LH در گروههاي دريافت كننده عصاره گزنه نسبت به ميانگين غلظت پالسمايي هورمون LH در گروه كنترل و شاهد تغييرات معني داري نسبت به يكديگر ندارند. اگرچه غلظت پالسمايي هورمون LH در گروههاي تجربي با دوز 50 mg/kg و 75 mg/kg عصاره گزنه نسبت به غلظت پالسمايي هورمون LH در گروههاي شاهد و كنترل افزايش داشته اما اين افزايش در سطح 0/05 p معني دار نمي باشد. تحقيق بر روي اثرات فالونوئيدها بر ميزان هورمون LH نشان مي دهد كه فالونوئيدها باعث افزايش ميزان هورمون LH در هيپوفيز قدامي در موش هاي صحرايي مؤنث در معرض استرس مي گردد )25( بنابراين با توجه به حضور فالونوئيدها در عصاره گزنه افزايش LH را مي توان انتظار داشت. orexins متعلق به گروهي پيام آورهاي هيپوتاالموسي كه باعث تعادل انرژي و توليدمثل مي باشد. orexin A به شدت ضربان هاي هورمون LH را تحريك مي كند. عمل تحريكي orexin A روي LH توسط استروژن قوي تر مي شود. در اين آزمايش احتماال با حضور فالونوئيدها و خاصيت ممانعت كنندگي آروماتاز و كاهش استروژن باعث مهار اثر سركوبي orexin A بر روي LH و افزايش LH مي گردد. )21 (. همچنين با توجه به كاهش تستوسترون ناشي از عصاره در گروه تجربي با دوز mg/ 75 kg انتظار مي رود كه غلظت هورمون LH از طريق مكانيسم فيدبك منفي باال رود و اين افزايش در سطح 0/05 p معني دار باشد ولي در عصاره تركيبات فعالي از جمله فيتواسترولها از طريق كاهش گنادوتروپين ها از جمله LH اثرات تعديلي خود را اعمال مي كنند. عالوه بر اين β- سيتسترول كه يك فيتواسترول مي باشد هيچگونه تأثيري بر روي پاسخ هاي هيپوفيزي و حجم هسته هاي دي مورفيك جنسي در موشهاي صحرايي اخته ندارد )20(. نتایج نشان می دهد اختالف معنی داری در میزان هورمون FSH در گروه های تجربی با گروه کنترل و شاهد وجود ندارد. بررسی ها نشان می دهد ترشح FSH مستقل از GnRH است. از طرفی چون کلیرانس متابولیکی آن آهسته تر از LH است تغییرات آن چندان مشهود نیست ) 6 و 24 (. گيرنده هاي هورمون

7 تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره چهارم شماره چهاردهم علی قربانی رجنبری و همکاران 37 FSH در سطح سلولهاي سرتولي وجود دارند و هورمون FSH با اتصال به اين گيرنده ها باعث فعال شدن آنزيم آدنيليل سيكالز و افزايش غلظت camp و در نتيجه فعال شدن پروتئين كيناز (PKC) C در سيتوزول مي گردد. سپس زير واحد كاتاليتيكي فعال و وارد هسته شده و رونويسي از ژن ABP را فعال مي كند )(. هورمون FSH سنتز و ترشح ABP را افزايش داده و از اين طريق غلظت تستوسترون در داخل لوله هاي مني ساز جهت روند عادي اسپرماتوژنز فراهم مي گردد )12(. هورمون FSH براي شروع اسپرماتوژنز يعني شروع تقسيم ميتوز سلول هاي اسپرماتوگوني ضروري است )19(. بنابراين اختالل در ميزان هورمون FSH باعث ايجاد اختالل در روند اسپرماتوژنز مي گردد. همچنين هورمون FSH براي اتصال و چسبيدن اسپرماتيدها به سلولهاي سرتولي ضروري است )11(. تاثیر مقادیر مختلف غلضت عصاره هیدروالکلی گزنه بر غلظت سرمی هورمون تستوسترون نشان می دهد ميانگين غلظت پالسمايي هورمون تستوسترون گروههاي تجربي دريافت كننده دارو نسبت به ميانگين غلظت پالسمايي هورمون تستوسترون در گروه كنترل و شاهد كاهش يافته و اختالف معني دار بين غلظت پالسمايي هورمون تستوسترون در گروه دريافت كننده دوز حداكثر دارو نسبت به گروه كنترل و شاهد وجود دارد )0/05 p(. هورمون هاي استروئيدي برخالف هورمون هاي پپتيدي كه در وزیکول ترشحي انباشته مي شوند فقط متناسب با نياز ساخته و ترشح مي شوند و همچنين در سنتز هورمون هاي استروئيدي دو عامل مؤثر 1 -جذب و در دسترس بودن كلسترول داخل سلولي 2- تبديل كلسترول به پروگننولون )22( فيتواسترول هاي موجود در عصاره با كاهش فعاليت سيتوكروم P 450 )آنزيم كلسترول دسموالز( باعث كاهش تبديل كلسترول به پروگنولون در ميتوكندري مي شود كه باعث كاهش سنتز استروئيدها از جمله تستوسترون مي شود )13(. در مطالعه اي كه در آن تأثير عصارة گياه رازك بر محور هيپوفيز- گناد مورد بررسي قرار گرفت مشخص شد كه کاهش تستوسترون سرم خون تحت تأثير تزريق عصارة گياه رازك را احتماال مي توان به وجود تركيبات فيتواستروژني اين گياه نسبت داد. بدين معني كه با تجويز درازمدت عصارة گياه رازك ميزان استروژن پالسمايي خون افزايش پيدا كرده و اين افزايش استروژن عملكرد محور هيپوفيز گناد را تحت تأثير قرار داده و باعث كاهش ترشح تستوسترون از بيضه ها شده است )2 (. از آنجا كه گياه گزنه حاوي تركيبات فيتواستروژني مي باشد بنابراين چنين نتيجه اي را مي توان انتظار داشت. در مطالعه اي كه در آن اثر تعديلي عصارة برگ گياه گزنه بر روي سيستم هاي آنزيمي biotransformation آنزيمهاي آنتي اكسيدان الكتات دهيدروژناز و ليپیدپراكسيداز در موش صورت گرفت مشخص شد كه عصاره باعث كاهش معني داري در فعاليت سيتوكروم P 450 ردوكتاز مي شود )27( از آن جایی كه P 450 و سيتوكروم P 450 مي توانند با اتصال به پروژسترون باعث توليد آنزيمهاي آندروژن توسط سلول هاي اليديگ شوند )17( احتماال گزنه با P 450 در سلول هاي اليديگ و جلوگيري مهار عملكرد سيتوكروم از عملكرد طبيعي هورمون هاي استروئيد جنسي موجب توقف واكنش هاي فوق شده و ميزان تستوسترون كاهش مي يابد. مقایسه فتومیکروگراف گروههای کنترل و شاهد با گروه های تجربی نشان می دهد در گروه تجربی 2 بتدریج فاصله لوله های اسپرم ساز افزایش و تراکم آنها کاهش یافته اما در گروه تجربی 3 عالوه بر کاهش لوله های اسپرم ساز اندکی به هم ریختگی و تخریب در آنها مشاهده می شود. مطالعات نشان داده تستوسترون نقش زیادی در حفظ و نگهداری بیضه دارا می باشد )7 (. با توجه به اینکه میزان تستوسترون در این پژوهش کاهش معنی دار در گروه تجربی 3 نشان داده پس اثرات منفی ایجاد شده روی بافت بیضه از این طریق محتمل است. نتیجه گیری به طور کلی مصرف گياه گزنه با دوز mg/kg 75 به مدت 2 روز باعث كاهش غلظت سرمي هورمون تستوسترون مي شود. فيتواسترولها با كاهش فعاليت سيتوكروم 450 p باعث كاهش تبديل كلسترول به پروگننولون و در نتيجه كاهش سنتز استروئيدها از جمله تستوسترون مي شوند. از طرفي ديگر فيتواسترولها و كومارين موجود در عصاره گياه باعث اثرات آنتي آندروژني شده و از اين طريق اثرات خود را اعمال مي كنند. مصرف گياه گزنه با دوز 75 و 50 mg/kg به مدت 2 روز باعث كاهش وزن بدن و وزن بيضه ها مي شود. فيتواسترول كومارين و لينولئيك اسيد موجود در اين گياه باعث كاهش ميزان كلسترول

8 تازه های بیو تکنولوژی سلولی - مولکولی دوره چهارم شماره چهاردهم بهار 1393 بررسی تاثیر... تام و كلسترول LDL مي شوند كه اين كاهش كلسترول بطور مستقيم باعث كاهش وزن بدن مي شود. همچنين فالونوئيدها و فيتواسترولهاي موجود در گياه آنزيم 5 آلفا ردوكتاز را مهار مي كند در نتيجه تستوسترون به دي هيدروتستوسترون تبديل نمي شود. چون وجود هورمونهاي جنسي براي افزايش توده بافتي ضروري است مسلما كاهش تستوسترون باعث كاهش وزن بيضه ها مي شود. از طرفی مصرف گياه گزنه با دوز 75mg/kg به مدت 2 روز باعث كاهش تعداد سلول هاي اسپرماتوگوني اسپرماتوسيت اوليه اسپرماتيد اليديگ و تراكم اسپرم مي شود. به نظر مي رسد كاهش كلسترول سنتز آندروژنها از جمله تستوسترون را كاهش مي دهد و كاهش آندروژنها مي تواند بر روند اسپرماتوژنز تأثير گذاشته باعث كاهش توليد اسپرم در لوله هاي سمينيفر شود. نتیجه کلی این که می توان از آن در جهت تنظیم باروری در جنس نر و ایجاد ناباروری استفاده نمود هرچندمطالعات بیشتری در این زمینه پیش نهاد می گردد. 3

9 تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی دوره چهارم شماره چهاردهم علی قربانی رجنبری و همکاران منابع 1- جیمز. آ. دوک. فرهنگ گیاهان دارویی ترجمه وتحقیق : دکتر زهره آموزگار دکتر عبدالعلی محقق زاده دکتر محمد رضا شمس اردکانی.) 137( چاپ اول انتشارات مارلیک صفحات : خاک پور شهرزاد. عریان شهربانو. حائری روحانی سید علی. امین غالم رضا. یحیوی سید حسین. ( 13(. بررسی اثر عصاره گیاه رازک بر هورمون های محور هیپوفیز- گناد در موش سوری نر فیزیولوژی-فارماکولوژی )1(: دلنواز هاشملويان بابك. عطائي عظيمي عذرا.) 136(. خواص دارويي و خوراكي گياهان با تأكيد بر گياهان ساوه مؤسسه انتشارات دانشگاه آزاد اسالمي واحد ساوه تابستان صفحات: ذبيحي خليل اهلل. ( 13(. مطالعه تجربي تأثير داروي والسارتان بر محور هيپوفيز-گناد و تغييرات بافتي بيضه در موشهاي صحرايي نر بالغ پايان نامه براي دريافت درجه كارشناسي ارشد دانشگاه آزاد اسالمي واحد كازرون. 5- رنج دوست صديف.) 132 (. بررسي اثرات هيپوگليسميك عصاره Urtica dioica بر روي رت هاي سالم وديابتي پايان نامه براي دريافت درجه دكتراي داروسازي شماره پايان نامه: شهبازی پرویز. ملک نیا ناصر. بیوشیمی عمومی جلد دوم چاپ هفدهم تهران مؤسسه انتشارات و چاپ دانشگاه تهران پاییز 137 صفحات: ضمیری محمد جواد. ( 135(. فیزیولوژی تولید مثل چاپ اول رشت: انتشارات حق شناس صفحات: Adam,J.A., Menhere, P.P.C.A., Van Dielen, F.M., Soeters, P.B, Decreased plasma Orexin A level in obese individuals, Endocrinology, 2002; Vol 26, NO 2, Aghilikhorasani A. Treasure of spice. Islamic revolution education press. 1992; pp: Baumgartner, W. A., P. F. Jones, W. A. Baumgartner, and C. T. Black. Radio-immunoassay of hair for determining opiate-abuse histories. J. Nucl. Med, 1979; 20: Choi JS, Kang TS, Kwack SJ, Min BS, Ha DT, Ngoc TM, Hung TM, Thuong PT, Bae K, Antioxidant activities of coumarins from Korean medicinal plants and their structure- activity relationships, College of Pharmacy, Chungnam National University, Daejeon, 2009; Elizabeth, S., Effect of selection for testosterone production on testicular morphology and daily sperm production in pigs, (Dr.Joseph Cassady ), J. Anim,2004; 2: Gilman, CL., Flush, F.D., Breckenridge, WC., Maclatchy, DL., Effects of phytosterol mixture on male Fish plasma Lipoproteins and testis P450 SCC activity, Department of Biology and Canadian Rivers Institute university of new Brunswick, 2000; 32(2) James A, Duke, Phytochemical databases, Beltsvilla Argriculture Research center. Green Farmacy Garden, kavalali G, Tuncel H, Goksel S, Hatemi HH, Hypoglycemic activity of Urtica pilulifera in streptozotocin-diabetic rats. Ethanopharmacol, 2003; 4(2-3) : Kulshereshta AS, Farnsworth NR. Botanical sources of fertility regulation agents, Chimistry and Pharmacology. Prog. Horm. Biochem. Pharmacol,1999;1: Morrela, MY., Flynn, KL., Seale, CG., Done, C., Paulson, AJ., Flaster, ER., Ferin,M., Reproductive dye function in woman with epilepsy :antiepileptic drug effects o sex-steroid hormones. CNS spectr, 2001; 6(9):771-2, Parvizpur A, Ahamadiani A, Kamalinejad M.Probable Role of Purinergic System in Antinociceptive Effects of Trigonella foenum- raecum Leaves Extract, 14th International Congress of Geographic Medicine and 15th Iranian Congress of Physiology and Pharmacology. Shiraz- Iran, 2001; 5 -, p: Plant, Toni.M., Gary,R.MARSHALL., The significane of FSH in spermatogenesis and the control of its secretion in male primates, Department of biology and physiology and medicine university of Pittsburg school of medicine Pittsburg, Pennsylvania, Register, B.,Bethel, M.A., Thompson, N.N., Wlmer,D., Bloha, P., Ayyash, L., Hughes,C., The effect of neonatal exposure to diethyl stilbestrol, coumestrol, and beta-sitosterol on pituitary responsivenss and sexully dimorphic nucleus volume in the castrated adult rat, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1995; 20: Shuye, P.U., Jain, M.R., Kalras, P., Orexin A novel family of Hypothalamic neuropeptides modulate pituitary LH secretion in ovarian steroid- dependent manner, 199; Vol 7 : Sable, D. (2004) Waking up and getting engaged: Transformative learning in the university classroom. Shambhala Institute Community. Retrieved May 23, Testai T, Chericoni S, Calderone V at all,. Cardiovascular effects of Urtica dioica L. (Urticaceae) roots extracts: in vitro and in vivo pharmacological studies, Journal of Ethnopharmacology. Volume 1,Issue1, June 2002 ; pages Turek, Paul.J., Hypothalamic-pituitary-gonadal axis and control of spermatogenesis, Director male reproductive laboratory department of urology university of California at San Francisco, Wang,C., Makela, T., Adlercreutz, H., Lignans flavonoids inhibit aromataz in human prediadiposit, J Steroid Biochem. Mol Bio, 1994; Vol 50: Wikipedia, the free encyclopedia, Özen, T., Korkmaz, H., Modulatory effect of Urtica dioica L. (Urticaceae) leaf extract on biotransformation enzyme systems, antioxidant enzymes, lactate dehydrogenase and lipid peroxidation in mice, Phytomedicine, 2003; Volume 10, Issue 5, PP: